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中国裸燕麦品种色氨酸含量的荧光检测与评价

时间:2018-01-11 13:12来源:《中国粮油学报》 , 2016 , 31 ( 作者:任 伟1,武 娇1,Olof 点击:
本试验旨在对我国主要裸燕麦栽培品种中色氨酸的含量水平进行评价,并分析其与蛋白质含量的关系。利用木瓜酶对新鲜燕麦粉进行水解,在激发波长288nm和发射波长352nm处检测水解产物的荧光强度,根据标准曲线对色氨酸含量进行定量。利用全自动蛋白质分析仪检测籽
任 伟1,武 娇1,Olof Olsson2
(1.山西农业大学1,太谷 030801;
2.瑞典隆德大学2,瑞典 22100)
 
摘 要:本试验旨在对我国主要裸燕麦栽培品种中色氨酸的含量水平进行评价,并分析其与蛋白质含量的关系。利用木瓜酶对新鲜燕麦粉进行水解,在激发波长288nm和发射波长352nm处检测水解产物的荧光强度,根据标准曲线对色氨酸含量进行定量。利用全自动蛋白质分析仪检测籽粒中总氮的含量来定量蛋白质,同时对9个裸燕麦栽培品种在4个不同产区种植的蛋白质和色氨酸含量分别进行检测并作显著性差异和相关性分析。结果表明,中国裸燕麦品种平均的色氨酸含量为2.39mg/g,大于国外报道的皮燕麦品种平均色氨酸含量1.70mg/g。品种和地区以及两者互作引起的燕麦色氨酸含量的差异显著,且燕麦色氨酸和蛋白质含量之间具有一定的相关关系,相关系数为0.353。
关键词:燕麦;色氨酸;荧光光谱 
色氨酸是人体必需的氨基酸之一,在蛋白质合成中起着重要的作用[1],也是机体烟酸合成的唯一来源[2]。最新的研究报道,色氨酸可减轻抑郁症状[3],摄入富含色氨酸的谷物可以改善睡眠质量,增强机体的抗氧化水平[4]。谷物是人体蛋白质及氨基酸摄入的主要来源,其中的色氨酸含量是评价蛋白质品质的指标之一[5]。尤其在一些发展中国家,饮食结构主要以单一谷物为主,提高蛋白质的含量和品质就显得更为重要。蛋白质中的氨基酸,特别是谷物籽粒蛋白质中的色氨酸,定量测定是比较困难的,这是因为在普通的酸水解过程中,色氨酸全部被破坏掉,而用碱水解又破坏了其他氨基酸[6],应用氨基酸自动分析仪和HPLC分析单项色氨酸的成本很昂贵,不易推广。由于蛋白质水解后在270~300nm处有吸收,这种吸收主要来自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸,当激发波长为280nm时,蛋白质水解液大致有相同的荧光光谱,最大值在313nm和350nm处,前者恰与酪氨酸一致,后者与色氨酸一致,所以可以设定发射波长为350nm,对色氨酸进行含量检测[8]。使用荧光光谱检测色氨酸含量目前在食物和湖水中也已经有过报道,此方法结果准确,并且比HPLC方法准确度和灵敏度高,但是利用荧光检测色氨酸含量在谷物籽粒中还鲜见有关报道[7-9]。
燕麦是一种富含膳食纤维高营养的谷物,其营养保健功能日益突显,燕麦在谷物中蛋白质含量较高,且氨基酸组成均衡,因此其营养价值被认为优于其他谷物[10-11]。林伟静等[12]曾对我国燕麦籽粒中各种营养成分包括氨基酸含量进行了评价,但对色氨酸含量却未做检测和评价。国外有文献报道燕麦粉中色氨酸的含量大约在1.7mg/g[13],而我国的裸燕麦籽粒中色氨酸含量鲜有报道。本研究应用荧光分析法对燕麦籽粒中色氨酸含量进行了检测,并在此基础上对我国主要裸燕麦品种在不同产区的色氨酸含量差异做出了分析。
 
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
燕麦种子:中国农业科学院作物研究所,9个不同品种于2011年分别在内蒙古武川、河北张家口、甘肃定西和吉林白城4个主要产区种植,品种均为裸燕麦,其中内蒙古地区的晋燕8号和甘肃的晋燕14号因倒伏未收获,其余材料收获后在室温下干燥。干燥的籽粒研磨用实验室微型磨:德国Fritsch公司,型号为Mini-Mill Pulverisette 23,研磨速度设置为45次/s,研磨时间为30s,获得的新鲜燕麦全粉用于检测;荧光强度的检测使用荧光计:美国PTI公司,型号为Photon technology intetnational 814;全自动蛋白质分析仪:荷兰Skalar公司,型号为Primacs S N。
木瓜蛋白酶溶液、EDTA、二硫苏糖醇(Dithiothreitol)、尿酸和硼酸钠:Sigma- Aldrich Sweden AB公司;谷氨酸标准品:Fluka公司。
1.2 试验方法
1.2.1 试剂的配制
水解液:使用新鲜配制的水解液,每周配制1次。用去离子水配制200mL水解液,分别加入尿酸、硼酸钠、二硫苏糖醇和EDTA,使终浓度分别为8、0.1、0.005和0.002mol/L,调整pH值至7.6。
色氨酸的标准液:先配制标准液的贮存液,使用时再稀释,标准液最终浓度为0.392nmol/μL。
1.2.2 样品的酶解
参照Oste[8]的方法使用木瓜酶水解燕麦粉。称取50mg的新鲜燕麦粉(其中蛋白质质量分数约为15%),装入水解管,加入1mg木瓜酶,酶活性为16~40U/mg蛋白质,然后加入5mL水解液,置于恒温37℃,振荡水解24h,酶解后10000r/min离心20min,4℃,上清液直接用于荧光分析。
1.2.3 色氨酸的检测
参照Oste[8]的方法对样品进行激发波长和发射波长扫瞄,确定最佳激发波长为288nm,最佳发射波长为352nm。在此条件下测定样品的荧光强度,对于每个样品,首先加入3mL含0.1mol/L硼酸钠的8mol/L尿酸溶液(pH7.6)作为空白,读数,然后在空白管中加入200μL的待测样品溶液,再次读数。荧光检测在室温下进行。
1.2.4 标准曲线的制定
取3mL含0.1mol/L硼酸钠的8mol/L尿酸溶液(pH7.6)读数,作为空白,依次加入10、20、30、40、50μL的色氨酸标准溶液,分别读数,每个标准液分析10次,求平均值,制定工作曲线。所得的标准曲线为y=68202x+4077.2(R2=0.999),具有良好的线性关系,色氨酸含量在0~5μg/mL范围内检测效果最佳。
1.2.5 蛋白质含量检测
称取约100mg左右的新鲜燕麦粉,利用全自动蛋白质分析仪检测籽粒中总氮的含量,粗蛋白含量与氮含量之间的转化系数为6.25。
1.2.6 数据分析
采用Microsoft Excel进行数据处理, 用 StatSoft软件进行ANOVA显著性分析和相关性分析。测定样品重复次数为n=3。
 
2 结果和分析
2.1 脱脂对荧光检测色氨酸含量的影响
在预试验中选取皮燕麦品种Belinda进行了脱脂和脱壳处理,对脱脂和脱壳前后样品的色氨酸含量做了比较,结果见表1,脱脂后色氨酸含量大于未脱脂籽粒的含量,差异显著(P<0.05),结果与文献[14]报道一致,因此,如果只是对大量样品的色氨酸含量进行初步筛选,或者几个样品之间做平行比较,可以省去脱脂这一步。另外,脱壳后的籽粒色氨酸含量要高于未脱壳籽粒,但差异不显著(P>0.05),表明蛋白质和氨基酸主要储存在胚乳中,壳里相对含量很少。
2.2 不同燕麦品种的蛋白质和色氨酸含量的差异
表2和表3列出了9个品种分别在不同产区种植的蛋白质和色氨酸的含量。由表2可以看出,对于9个品种而言,在不同地方的蛋白质平均含量值在14.99~18.18%之间,其中坝莜1号最高,晋燕14号最低。对于不同地区,各品种的蛋白质的平均含量范围在16.53~17.50%之间,山西较高,甘肃次之,其次是内蒙古,吉林最低,地区间的差异不显著。同一品种的蛋白质含量在不同地区间无显著差异,不同品种之间的蛋白质含量有显著差异,晋燕14号的蛋白质含量显著低于其它8个品种,差异水平在0.05,结果见表2。
从表3可知,不同品种在地区间的变异较广,其中定莜1号最大,为15.42%;白燕2号最小,为0.4%。对于4个产区来说,各品种的平均色氨酸含量范围在2.20mg/g(吉林)到2.55mg/g(山西)之间,同一品种的色氨酸含量在不同地区间的差异显著,山西最高,内蒙古次之,二者都显著高于甘肃和吉林地区,吉林种植的品种色氨酸含量表现为最低。
9个燕麦品种分别在山西,内蒙古,甘肃和吉林4个地方种植的色氨酸含量的变异分析见表4,相对而言,地区对色氨酸含量变异的贡献大于品种以及两者互作的贡献,且地区间差异极显著,品种间也存在显著差异,显著水平为0.05,品种和地区的互作引起的差异也极显著。
表4 9个品种在4个产区色氨酸含量的变异分析
变异来源 自由度 总方差 平均方差 F值 P值
总变异 34 326.96 326.96 12774.67 0.00
品种 8 0.38 0.06 2.50* 0.05
地区 3 1.10 0.37 14.38** 0.00
品种×地区 22 1.38 0.08 3.00* 0.00
标准误差 28 0.72 0.03
 
注:*显著相关水平为0.05。
 
2.3 色氨酸含量和蛋白质含量之间的相关关系
从结果可以看出,蛋白质含量仅在品种间有显著差异,地区间无显著差异;而色氨酸含量在品种间无显著差异,在地区间有显著差异,种植在内蒙古的坝莜1号蛋白质含量最高,高达19.11%,其色氨酸的含量也最高,达2.83mg/g,显著高于在甘肃和吉林两地种植的坝莜1号。对所有34个样品的蛋白质和色氨酸含量进行Pearson相关性分析,结果表明,色氨酸含量和蛋白质含量之间有显著的负的线性相关关系(P<0.05),相关系数为0.353,公式为y=-0.147x+16.905(R2=0.00053)。
 
3 讨论
燕麦蛋白质含量高且氨基酸含量均衡,而且是谷物中唯一含有结晶球蛋白的作物,这种球蛋白作为近80%的储存蛋白存在于燕麦籽粒中[15]。Landry等[16]曾经对不同谷物如小麦、玉米和大麦籽粒中的色氨酸含量与含氮水平的关系进行了分析,得出色氨酸含量与籽粒中含氮水平呈一定的线性关系的结论,但色氨酸含量与蛋白质含量的水平却不一致。究其原因可能是色氨酸含量的变异主要来源于富含色氨酸的某种蛋白质,而与总蛋白质的含量并不存在线性关系。但本研究发现,在燕麦籽粒中,色氨酸的含量与总蛋白质的含量水平有一定的显著性线性关系。燕麦比其他作物含有较高的色氨酸,如小麦1.70mg/g,玉米0.68mg/g,大麦1.40mg/g,豌豆0.70mg/g[17-19]。Wieser[20]曾报道,色氨酸主要集中在白蛋白和谷蛋白中,而在醇溶谷蛋白中则含量极少。燕麦与小麦等其他谷物不同,醇溶蛋白的含量相对较低,约4~15%[21],而白蛋白和谷蛋白含量相对较高,这可能是造成燕麦色氨酸含量与其总蛋白质含量有一定相关性的原因。
 
4 结论
本试验对我国主要裸燕麦栽培品种的色氨酸含量水平进行了评价,9个主要栽培品种的色氨酸含量有显著差异,平均为2.39mg/g,高于国外报道的皮燕麦的色氨酸平均含量1.70mg/g,其中花早2号平均含量最高,达2.50mg/g,比国外报道的皮燕麦色氨酸含量高出近47.05%。说明我国裸燕麦资源的色氨酸含量可能高于国外皮燕麦品种,具有一定的加工利用优势。而且色氨酸含量随环境因素变化会有一定差异,差异的来源与燕麦不同蛋白质组分之间的关系还有待进一步研究。这将对燕麦品质育种和加工利用提供一定的信息。
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(责任编辑:lsgy100)
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